酪蛋白酸钠添加量对Zein纳米

颗粒稳定性影响的分析研究

引用格式

杨晶然，李慧鑫，万芮宁，等.酪蛋白酸钠添加量对Zein纳米颗粒稳定性影响的分析研究[J].农产品加工,2025,(20):69-74+82.

基金项目

黑龙江省自然科学基金项目（LH2023C067）；黑龙江省大学生创新创业项目（202310234011，202310234019，S202410234073X）；哈尔滨市科技计划自筹项目（2023ZCZJCG008）。

摘   要

研究了酪蛋白酸钠（Sodium caseinate，CN）和玉米醇溶蛋白（Zein）比例对复合纳米颗粒环境稳定性和乳化稳定性的影响。利用傅里叶红外光谱、扫描电镜和纳米粒度电位仪测定不同复合纳米颗粒理化性质。同时，研究了复合纳米颗粒在冻融、加热、pH值等条件下的环境稳定性和乳化稳定性。结果发现，不同比例CN和Zein均成功制备形成复合纳米颗粒。与Zein纳米颗粒相比，随着CN浓度增加，复合纳米颗粒尺寸及粒径之间变化差异变小。与Zein纳米颗粒电位相比，CN改变了Zein纳米颗粒的电位，复合纳米颗粒电位在-33.29~-37.65 mV内变化。在冻融、加热、改变pH值等环境条件下，不同CN+Zein复合纳米颗粒均具有较高的稳定性，且这些复合纳米颗粒也具有很好的乳化稳定性。

关 键 词

玉米醇溶蛋白；酪蛋白酸钠；环境稳定性；

乳化稳定性

正   文

玉米醇溶蛋白（Zein）是玉米加工副产品中主要贮藏蛋白，其富含疏水氨基酸（>75%），易溶于体积分数55%~95%（V/V）乙醇水溶液、pH值> 11水介质和阴离子表面活性剂溶液。Zein作为一种有前景的食品级配料，具有资源丰富、价格低廉、生物兼容性高和可降解等优点。强疏水性和生物兼容性赋予Zein自组装形成纳米/微米颗粒、膜、纳米纤维、凝胶等聚合物，用于包封和递送生物活性化合物（如姜黄素、亚麻油、维D₃、精油灯）^[1-2]。而且Zein富含脯氨酸，有利于高药物载量^[3]。制备Zein纳米/微米颗粒的方法主要包括反溶剂法、喷雾干燥法、超临界反溶剂法、乳化沉淀法、化学交联法和冷凝胶法等^[4]。但是，单独Zein自组装形成的纳米颗粒不稳定，在Zein等电点（pI）附近、高离子强度等条件下容易聚集，且存在尺寸调控困难等缺点^[5]。酪蛋白酸钠（Sodium caseinate，CN）含有4种主要成分（αs1-、αs2-、β -和κ -酪蛋白），具有双亲性^[6]。CN通常用作表面活性剂，促进纳米粒子分散和胶束形成^[7]。此外，水介质中CN和Zein具有相反ζ电位，受到静电吸附束缚可调控Zein纳米颗粒粒径和电位^[1]。CN可提高Zein纳米颗粒的稳定性和实现Zein纳米颗粒尺寸的调控^[1-2，8]。但是，不同比例的CN对Zein纳米颗粒贮藏稳定性和乳化稳定性的影响规律没有系统研究。

因此，反溶剂法将不同CN和Zein复合，制备不同复合纳米颗粒。利用傅里叶红外光谱、扫描电镜、纳米粒度及Zeta -电位分析仪等对其结构和理化性质进行表征。同时，还探究了冻融、加热和pH值条件下复合纳米颗粒的稳定性，此外还评估了不同复合纳米颗粒的乳化稳定性，为制备环境高稳定性和高稳定乳化液的复合纳米颗粒提供指导。

1 材料和方法

1.1 材料

Zein（Z3625）、CN，Sigma Aldrich公司提供。

1.2 试剂

大豆油，益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司提供；盐酸，上海祯泰化工有限公司提供；乙醇，济南衍德生物科技有限公司提供；十二烷基磺酸钠，上海尚宝生物科技有限公司提供。

1.3 仪器与设备

Allegra64R型高速离心机，德国Beckman公司产品；N-1200B型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司产品；FSH-Ⅱ型高速电动匀浆机，常州国宇仪器制造有限公司产品；IS50型傅里叶红外光谱仪，赛默飞世尔科技公司产品；FV3000型激光共聚焦，日本奥林巴斯公司产品；UV-2550型紫外可见光分光光度计，日本岛津公司产品；Nano-ZS型纳米粒度电位仪，英国MalvernPanalytical公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 样品的制备

采用反溶剂法制备复合纳米颗粒^[9]。利用体积分数80%乙醇水溶液配制质量分数为2.5%的Zein溶液。利用去离子水配制质量分数分别为0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%的CN溶液。将250 mL的5个CN溶液置于25 ℃的搅拌水浴锅中，然后将5份质量分数为2.5%的Zein溶液100 mL分别边搅拌边滴加到5个CN溶液中（滴加时间保持在15 min）。将滴加完毕后的溶液以转速3 000 r/min离心20 min，取上清液。然后利用旋转蒸发仪将溶液中的乙醇除去，样品冻干备用。

1.4.2 傅里叶红外光谱的测定

将冻干样品和溴化钾同时研磨成粉末，并使用压片机压制成透明片材^[2]。使用FTIR分光光度计记录红外光谱，波数为4 000~400 cm^-1，扫描时间为16 s^-1。

1.4.3 扫描电镜的表征

采用扫描电镜观察5种复合纳米颗粒的微观形态。将5种样品涂抹在双面导电胶上，然后进行喷金处理。在电压为15 kV条件下观察聚合物的形态，成像并保存照片。

1.4.4 粒径和电位的测定

将不同质量分数（0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%）CN和Zein复合纳米颗粒的质量浓度稀释成6 mg/mL，然后采用Malvern纳米粒度电位分析仪测定溶液的粒径大小和强度分布。其中，水的折射率为1.33、样品的折射率为1.53，测试温度为室温。

1.4.5 冻融稳定性

将样品在-20 ℃下冷冻24 h，然后在25 ℃下解冻，24 h后评估样品颗粒尺寸大小和分布及表面电荷^[10]。

1.4.6 热稳定性

将样品在85 ℃下水浴30 min，然后冷却至室温，测定样品粒径强度分布、平均粒径和表面电荷^[11]。

1.4.7 pH值稳定性

采用磁力搅拌器以转速500 r/min连续搅拌下加入浓度为1 mol/L的NaOH溶液或HCl溶液，将样品的pH值调节至2.0，4.0，6.0，8.0，24.0 h后，用紫外可见分光光度计测定波长600 nm处的浊度值。

1.4.8 乳化稳定性

将不同的样品分别稀释至质量分数为1%，以样品溶液和大豆油3∶1（V/V）混合，以转速12 000 r/min均质2 min，分别在0 min和10 min从底部取乳液50 μL，加入到5 mL质量分数0.1%的十二烷基磺酸钠（SDS）溶液中，混合均匀，于波长500 nm处测定吸光度，以0.1% SDS空白调零^[12]。每个样品重复3次。乳化稳定性（ESI）计算公式如下：

式中：ESI——乳化稳定性；

A_{0——0 min时的吸光度；}

A₁₀——10 min时的吸光度。

1.4.9 激光共聚焦

利用激光共聚焦观察不同复合纳米颗粒的乳 化液微观形态^[13]。将5 mL乳液与125 μL质量浓度1 mg/mL的尼罗红（异丙醇作为溶剂）和125 μL质量浓度10 mg/mL的尼罗蓝（异丙醇为溶剂）充分混合，避光染色30 min。然后，将混合物涂抹在带有盖玻片的显微镜载玻片上，并用60×油透镜进行观察。混合物于波长488 nm（尼罗红）和633 nm（尼罗蓝）处激发，观察乳液的微观结构。

2 结果与分析

2.1 傅里叶红外光谱的分析

不同CN+Zein复合纳米颗粒傅里叶红外光谱见图1。

傅里叶红外光谱用于研究二元纳米颗粒之间潜在分子间的相互作用。所有样品于波数3 200~3 500 cm^-1处都出现了较宽波段，这是由于O-H基团的拉伸振动^[14]。随着CN添加量增加，样品在波数3 100~ 3 500 cm^-1处特征峰发生了偏移，说明Zein与CN结合形成复合纳米颗粒的驱动力为氢键[1]。单独Zein波峰分别在波数3 012，2 358，1 581，1 460，1 328， 933 cm^-1处。在CN质量分数为0.5%时，波数3 012 cm^-1处峰还在，但是当质量分数进一步增加至1.0%以上时，此峰消失。当CN质量分数增加至1.5%时，波数2 358 cm^-1处的峰值减小。酰胺I带（位于波数1 600~1 700 cm^-1）主要关联于羰基（C=O）的拉伸振动模式，而酰胺II带（位于波数1 500~1 600 cm^-1）则与碳氮键（C-N）的拉伸振动及氮氢键（N-H）的弯曲振动模式紧密相关。随着CN质量分数的改变，酰胺I和酰胺II的峰也发生了移动，表明Zein复合纳米粒子发生了复合。

2.2 微光形态分析

CN+Zein复合纳米颗粒扫描电镜图见图2。

利用扫描电镜观察CN+Zein复合纳米颗粒微观形态。天然Zein形成了均匀的球状结构，CN形成了无定形的聚合物。当CN质量分数为0.5%时，复合纳米颗粒保持了球状的结构；当CN质量分数为1.0%时，有部分球状聚合物和片状的不定型聚合物；当CN质量分数增加至1.5%和2.0%时，聚合物形成了片状的聚合物，但在片状聚合物上明显存在球状结构。这些结果说明CN和Zein成功复合，与傅里叶红外光谱结构一致。

2.3 粒径和电位的分析

不同复合纳米粒径和电位的变化见图3。

粒径是评估聚合物在水溶液中相互作用强度的一个重要参数。由图3（a）可知，5种复合纳米颗粒的粒径强度分布均为单峰分布。由图3（b）可知，Zein纳米颗粒粒径为595.17 nm，0.5%，1.0%，1.5%，2.0% CN和Zein形成复合纳米颗粒的粒径分别为202.70，194.90，196.27，201.30 nm。CN改变了Zein纳米颗粒的粒径，但不同质量分数CN对复合纳米颗粒粒径的改变程度差异较小。由图3（c）可知，CN改变了Zein纳米颗粒的电位。与Zein纳米颗粒电位相比（26.44 mV），随着CN质量分数从0.5%增加至2.0%，复合纳米颗粒的电位分别为-33.29，-36.28，-36.95，-37.65 mV。随着CN质量分数的增加，复合纳米颗粒电位绝对值增加，因为带负电的CN包裹在Zein纳米颗粒的表面，改变了颗粒表面的电荷属性。这种吸附的驱动力主要取决于直接分子相互作用和静电相互作用^[5，10]。Zeta电位通常用来反映分散体系的稳定性，电位的绝对值越大，即无论是正值还是负值，体系内粒子间的静电斥力就越显著，这有助于增强体系的稳定性^[11]。当纳米颗粒的电位绝对值超过30 mV时，体系展现出了卓越的稳定性^[1]。这种稳定性的提升源于粒子间强烈的静电斥力，有效地阻止了颗粒的聚集和沉淀，从而确保了体系的长期稳定，因为粒子间的静电斥力可阻止粒子之间的聚集和沉淀。因此，CN+Zein复合纳米颗粒溶液均较为稳定。Zein与CN复合时，Zein疏水性强，形成复合纳米颗粒的内核，而CN两亲，位于纳米颗粒外部^[15]。即具有疏水链段CN分子的一部分通过疏水相互作用嵌入Zein纳米颗粒疏水内核中，而亲水链段通过静电吸引力和空间相互作用包围Zein纳米粒径外部^[16]。CN的电位为-25.0 mV，CN带负电荷^[17]。

2.4 稳定性分析

2.4.1 冻融稳定性

复合纳米颗粒冻融后粒径强度分布、平均粒径和电位的变化见图4。

由图4（a）可知，冻融后不同复合纳米颗粒的粒径强度分布呈单峰分布。由图4（b）可知，天然Zein纳米颗粒经过冻融后，其粒径从595.17 nm增加至2 066.67 nm。0.5%，1.0%，1.5%，2.0% CN和Zein形成复合纳米颗粒的粒径分别为202.70，194.90， 196.27，201.30 nm；冻融后4种复合纳米颗粒粒径分别为206.70，194.90，194.73，201.33 nm，说明CN复合提高了Zein纳米颗粒冻融稳定性。由图4（c）可知，天然Zein纳米颗粒经冻融后，其电位从26.44 mV降低至20.62 mV，变化幅度为22.01%。0.5%，1.0%，1.5%和2.0% CN和Zein形成复合纳米颗粒的电位分别为-33.49，-36.27，-36.95，-37.65 mV；0.5%，1.0%，1.5%，2.0% CN和Zein形成复合纳米颗粒冻融后电位分别为-33.07，-38.13，-38.23，-35.32 mV，变化幅度分别为1.25%，5.09%，3.44%，6.19%，变化幅度较小，说明CN复合提高了Zein纳米颗粒冻融稳定性。

2.4.2 热稳定性

复合纳米颗粒热处理后粒径强度分布、平均粒径和电位的变化见图5。

由图5（a）可知，加热后不同质量分数CN和Zein形成复合纳米颗粒的粒径强度分布仍呈单峰分布。与单独Zein纳米颗粒相比，CN与Zein形成纳米颗粒的粒径强度峰值明显发生右移。由图5（b）可知，天然Zein纳米颗粒经过加热后，粒径从595.17 nm增加至1 146.67 nm，变化幅度为92.67%。0.5%，1.0%，1.5%，2.0% CN和Zein形成复合纳米颗粒粒径分别为202.70，194.90，196.27，201.30 nm；加热后0.5%，1.0%，1.5%，2.0% CN和Zein形成复合纳米颗粒粒径分别为198.40，190.10，191.00，201.50 nm，变化幅度分别为2.12%，2.46%，2.68%，0.09%。由图5（c）可知，天然Zein纳米颗粒热处理后电位从26.44 mV降低至17.79 mV，变化幅度为32.69%。0.5%，1.0%，1.5%，2.0% CN和Zein形成复合纳米颗粒电位分别为-33.49，-36.27，-36.95，-37.65 mV；加热后0.5%，1.0%，1.5%，2.0% CN和Zein形成复合纳米颗粒电位分别为-32.95，-35.61，-37.11，-37.77 mV，变化幅度分别为1.62%，1.85%， 0.42%，0.31%。粒径和电位的结果均说明CN提高了Zein纳米颗粒的热稳定性。

2.4.3 pH值稳定性

pH值稳定性直观图和浊度值变化见图6。

由图6可知，Zein和不同质量分数CN形成复合纳米颗粒在调节至pH值2.0，4.0，6.0，8.0后，其直观图明显不同。天然Zein在调节至pH值2.0，4.0， 6.0，8.0时，均有沉淀产生，0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0% CN和Zein形成复合纳米颗粒在pH值4.0时均不稳定，可见聚集沉淀。在pH值4.0的浊度值分别为0.17，0.16，0.78，0.20，0.15，浊度值较小是因为大部分已经形成沉淀，测定上清液的颗粒很少，所以测定值小。相同质量分数CN和Zein复合纳米颗粒均在pH值6.0时浊度值较大，其次为pH值8.0，最后为pH值2.0。说明在pH值6.0条件较pH值2.0和pH值8.0条件不稳定。在pH值6.0时不稳定，粒径大，可见聚集，纳米颗粒在接近pI（pH值6.2）时表面电荷低^[18]。因此，纳米粒子之间的静电排斥力不足以抵消相互作用的吸引力（如疏水作用力），驱动分散体中纳米颗粒之间的聚集。不同复合纳米颗粒在pH值4.0条件下不稳定，可能是由于纳米颗粒分散体的pH值接近CN分子的理论pI（pH 值4.6）^[19]，导致表面电荷损失。

2.5 乳化稳定性分析

不同CN+Zein复合纳米颗粒乳化稳定性和激光共聚焦扫描电镜图见图7。

由图7（a）可知，不同复合纳米颗粒形成乳化液的稳定性也呈现一定变化。Zein纳米颗粒乳化稳定性为31.34%，而0.5%，1.0%，1.5%，2.0% CN和Zein复合纳米颗粒的乳化稳定性提高至78.07%，80.02%，80.50%，84.89%。

由图7（b）可知，利用激光共聚焦观察0，0.5%， 1.0%，1.5%，2.0% CN和Zein复合纳米颗粒的乳化液的微观形态图。利用尼罗蓝染色蛋白纳米颗粒层呈绿色，尼罗红染色油呈红色，然后贮藏24 h后观察其微观形态。单独Zein纳米颗粒制备的乳化液不能很好地包裹在油的表面，说明形成的乳化液较差。通过反溶剂法制备的Zein纳米颗粒形成了10~200 μm的皮克林乳化液，但乳化稳定性较差，且Zein纳米颗粒表面疏水性太强，进而制约了水包油型皮克林乳液乳液的构建^[20]。不同质量分数CN与Zein复合纳米颗粒均可形成很好的乳化性，纳米颗粒均可很好地包裹在油脂的表面。利用多种物质协同稳定食品级乳液已成为新的研究趋势，这有利于改善乳液的加工贮藏性，以扩大其在食品、制药等领域的应用^[21]。利用Zein纳米颗粒和CN共同制备皮克林乳液，与单独Zein纳米颗粒稳定的皮克林乳液相比，乳液的界面覆盖率提高，使得界面面积增大、体系自由能降低，对pH值和离子强度的稳定性提高^[22]。

3 结论

利用质量分数分别为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%的CN和Zein均成功制备复合纳米颗粒。所制备的复合纳米颗粒均具有较好的冻融稳定性和热稳定性，且复合纳米颗粒对Zein纳米颗粒的pH值稳定性也有一定程度改善。不同复合纳米颗粒均表现出良好的乳化稳定性。但是CN质量分数的改变对Zein环境稳定性和乳化稳定性改善程度差异较小。研究结果有利于构建尺寸稳定的复合纳米颗粒，以拓宽Zein在医药、食品等工业领域中的应用。

参考文献：

[1]CHEN H L，XU B G，ZHOU C S，et al. Multi-frequency ultrasound-assisted dialysis modulates the self-assembly of alcohol-free zein-sodium caseinate to encapsulate curcumin and fabricate composite nanoparticles[J]. Food Hydrocolloids，2022（122）：107110-107117.

[2]ZHANG H H，LIU R，WANG J T，et al. Fabrication，characterization，and lipid-lowering effects of naringen- inzein-sodium caseinate-galactosylated chitosan nanopa- rticles[J]. International Journal of Biological Macromole-cules，2023（230）：123150-123158.

[3]WANG Q，TANG Y，YANG Y，et al. Interactions and structural properties of zein/ferulic acid：The effect of calcium chloride[J]. Food Chemistry，2022（373）：131489-131497.

[4]唐瑜婉，王启明，杨雅轩，等. 玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒对 Pickering 乳液稳定性的调控[J]. 食品与发酵工业，2019，45（11）：280-285.

[5]MCCLEMENTS D J. Curcumin encapsulation in zein-rha-mnolipid composite nanoparticles using a pH-driven me-thod[J]. Food Hydrocolloids，2019（93）：342-350.

[6]LI H，XU Y，SUN X，et al. Stability，bioactivity，and bioaccessibility of fucoxanthin in zein-caseinate composite nanoparticles fabricated at neutral pH by antisolvent precipitation[J]. Food Hydrocolloids，2018（84）：379-388.

[7]YUAN Y，MA M，XU Y，et al. Surface coating of zein nanoparticles to improve the application of bioactive compounds：A review[J]. Trends in Food Science and Technology，2022（120）：1-15.

[8]PAN K，ZHONG Q. Low energy，organic solvent-free coassembly of zein and caseinate to prepare stable dispersions[J]. Food Hydrocolloids，2016（52）：600-606.

[9]ZHANG R，LI L，MA C，et al. Shapecontrolled fabrication of zein and peach gum polysaccharide based complex nanoparticles by anti-solvent precipitation for curcumin-loaded Pickering emulsion stabilization[J]. Sustainable Ch-emistry and Pharmacy，2022（25）：100565-100574.

[10]董世荣，玄丽琪，郭珊珊. 介质极性对柔性玉米醇溶蛋白乳化性的影响[J]. 食品工业科技，2022，43（17）：72-77.

[11]NOOSHKAM M，VARIDI M. Physicochemical stability and gastrointestinal fate of β-carotene-loaded oil-in-water em-ulsions stabilized by whey protein isolate-low acyl gellan gum conjugates[J]. Food Chemistry，2021（347）：129079-129085.

[12]RANA A，AVAD V M，MEHDI V，et al. Boosting emulsion properties：The role of β-sheet content and fibril length in soy protein isolate emulsions[J]. Food Hydrocolloids，2024（149）：109513-109520.

[13]DONG S，HAN Q，XU W，et al. Effect of solvent polarity on the formation of flexible zein nanoparticles and their environmental adaptability[J]. Journal of Cereal Science，2021（102）：103340-103349.

[14]李仁杰. 负载木犀草素的玉米醇溶蛋白-阿拉伯树胶-茶多酚纳米颗粒制备及抗氧化活性研究[D]. 芜湖：安徽工程大学，2023.

[15]LUO Y. Food colloids binary and ternary nanocomplexes：Innovations and discoveries[J]. Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2020（196）：111309-111317.

[16]CHENG C J，JONES O G. Stabilizing zein nanoparticle dispersions with iota-carrageenan[J]. Food Hydrocolloids，2017（69）：28-35.

[17]LIU Q Y，QIN Y，CHEN J J，et al. Fabrication，characterization，physicochemical stability and simulated gastrointestinal igestion of pterostilbene loaded Zein-sodium case-inate-fucoidan nanoparticles using pH-driven method[J]. Food Hydrocolloids，2021（119）：106851-106859.

[18]PATEL A R，BOUWENS E C，VELIKOV K P. Sodium caseinate stabilized zein colloidal particles[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2020，58（23）：12497-12503.

[19]DAVIDOV P G，GUMUS C E，MCCLEMENTS D J. Lu-tein-enriched emulsionbased delivery systems：Influence of pH and temperature on physical and chemical stability[J]. Food Chemistry，2026（196）：821-827.

[20]黎亢抗. 玉米醇溶蛋白纳米粒子的制备及其抗菌膜材料的研究[D]. 广州：华南理工大学，2013.

[21]朱雨晴，刘伟，陈兴，等. 食品级皮克林乳液的稳定机制及稳定性研究进展[J]. 食品工业科技，2018，39（7）：315-322.

[22]FENG Y，LEE Y. Surface modification of zein colloidal particles with sodium caseinate to stabilize oil-in-water Pickering emulsion[J]. Food Hydrocolloids，2016（56）：292-302. ◇