响应面法优化黄精多糖

提取工艺及抗氧化活性研究

引用格式

罗伟光，申锴，李秀伟，等.响应面法优化黄精多糖提取工艺及抗氧化活性研究[J].农产品加工，2025（21）：68-74.

基金项目

摘   要

为优化水提醇沉法提取黄精多糖的工艺，探究其抗氧化活性。以黄精多糖得率为指标，采用苯酚硫酸法测定黄精多糖得率，采用单因素试验对提取pH值、提取温度、提取时间、料液比4个因素进行考查。在单因素试验的基础上通过响应面试验对提取工艺进行优化。通过DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力试剂盒测定黄精多糖抗氧化能力。在提取pH值为7，提取温度为92 ℃， 料液比为1∶29（g∶mL），提取时间为154 min时，黄精多糖得率达到最大值，为9.37%。黄精多糖具有DPPH自由基清除能力（IC50=4.09 mg/mL）和ABTS+自由基清除能力（IC50=4.29 mg/mL），且抗氧化能力呈现剂量依赖。研究结果可为黄精多糖的高效提取和作为一种潜在天然抗氧化剂的开发应用提供理论依据。

关 键 词

黄精多糖；响应面；提取工艺；抗氧化活性

正   文

黄精为百合科黄精属多年生草本植物的干燥根茎，包括滇黄精（Polygonatum kingianum Coil et He- msl）、黄精（Polygonatum sibiricum Redoute）、多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua），属于传统的药食同源类中药^[1-2]。黄精性平、味甘，归脾、肺、肾经，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功效，用于治疗脾胃气虚、体倦乏力、胃阴不足、口干食少、肺虚燥咳、劳嗽咳血、精血不足、腰膝酸软、须发早白、内热消渴等^[3]。黄精含有多种活性成分，如黄精多糖、皂苷、生物碱、黄酮类化合物等，其中黄精多糖是黄精的主要活性成分^[4-5]。现代药理学研究表明，黄精多糖具有调节免疫、抗疲劳、抗肿瘤等药理活性^[6-8]。

随着对黄精多糖功能的深入研究，黄精多糖作为功能性食品和一种天然的免疫增强剂具有广阔应用前景^[9-10]。黄精多糖含量是评价黄精品质的重要指标^[11]，因此优化黄精多糖提取工艺具有重要意义。目前，黄精多糖的提取方法主要有水提醇沉法、复合酶解法、超声辅助提取法、超声波辅助酶法、超高压提取法、微波辅助提取法、离子液体-微波辅助法和超声波微波协同法等^[12-15]。其中，水提醇沉法是提取黄精多糖常用的方法，具有操作简单、安全环保、应用范围广等优势^[16]。因此，采用水提醇沉法提取黄精多糖，通过单因素试验和响应面法对水提醇沉法提取黄精多糖工艺进行优化，并研究其体外抗氧化活性。

1   材料与方法

1.1   材料与试剂

多花黄精购自湖南省，由黑龙江省中医药科学院王伟明研究员鉴定为百合科植物多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根茎；葡萄糖标准品、苯酚、盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、浓硫酸，均为分析纯；屈臣氏蒸馏水；DPPH自由基清除能力检测试剂盒（BC4755）、ABTS+自由基清除能力检测试剂盒（BC4775），北京索莱宝科技有限公司提供。

1.2   仪器

AF-20S型1 kg中药粉碎机，温岭市奥力中药机械有限公司产品；9140A型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；BSA224S-CW型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产品；HH-S21-8-S型水浴锅，上海新苗医疗器械制造有限公司产品；LGR20-W型高速离心机，北京京立离心机有限公司产品；Lambda365型紫外分光光度计，美国PerkinElmer公司产品；iMark型酶标仪，美国Bio-rad公司产品。

1.3   试验方法

1.3.1   黄精多糖提取

黄精根茎清水洗净后于60 ℃下干燥至恒质量，粉碎过筛后精密称取5 g黄精粉末，加入适量石油醚脱脂后，加热回流提取，过滤加适量无水乙醇使质量分数为80%，离心、干燥沉淀得到黄精粗多糖，采用苯酚-硫酸法测定黄精多糖得率^[17]。

1.3.2   葡萄糖标准曲线的建立

精密称取无水葡萄糖10 mg于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至100 mL配置葡萄糖标准溶液，分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL葡萄糖标准溶液，加蒸馏水至1.0 mL，分别加质量分数为6%的苯酚溶液1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，沸水浴15 min，冷却至室温，采用紫外分光光度计于波长490 nm处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

葡萄糖标准曲线见图1。

由图1可知，线性回归方程为Y=10.781X-0.026 6，R2=0.999 3，表明在质量浓度为0.02~0.10 mg/mL内具有良好的线性关系。

1.3.3   黄精多糖得率计算方法

按照1.3.1提取得到的黄精粗多糖用蒸馏水溶解定容至100 mL，吸取1 mL定容至50 mL，得到黄精多糖待测溶液，采用苯酚硫酸法测定黄精多糖得率。

黄精多糖得率计算公式如下：

式中：Y——黄精多糖得率，%；

       A490——黄精多糖待测溶液490 nm处吸光度；

       100——稀释倍数；

        50——稀释倍数；

         m——称取黄精粉末质量，g。

1.3.4   单因素试验

1）提取pH值对黄精多糖得率的影响。固定提取温度为80 ℃，料液比为1∶20（g∶mL），提取时间为120 min，设置提取pH值为5，6，7，8，9，考查提取pH值对黄精多糖得率的影响。

2）提取温度对黄精多糖得率的影响。根据1.3.4中1）试验结果，固定提取pH值为7，料液比为1∶20，提取时间为120 min，设置提取温度为60， 70，80，90，100 ℃，考查提取温度对黄精多糖得率的影响。

3）料液比对黄精多糖得率的影响。根据1.3.4中2）试验结果，固定提取温度为90 ℃，提取时间为120 min，提取pH值为7，设置料液比为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，考查料液比对黄精多糖得率的影响。

4）提取时间对黄精多糖得率的影响。根据1.3.4中3）试验结果，固定料液比为1∶25，提取温度为90 ℃，提取pH值为7，设置提取时间为60，90，120，150，180 min，考查不同提取时间对黄精多糖得率的影响。

1.3.5   响应面优化试验

综合单因素试验结果，运用Design Expert 13软件，选取提取pH值（A）、提取温度（B）、料液比（C）和提取时间（D）4个因素，以黄精多糖得率为响应值，根据Box-behnken试验设计原理设计响应面试验。

响应面试验因素与水平见表1。

1.3.6   体外抗氧化试验

1）DPPH自由基清除能力检测。根据试剂盒说明，将黄精多糖溶解于提取液中，配置为质量浓度1，2，3，4，5 mg/mL的黄精多糖溶液。以维C为阳性对照，将维C溶解于提取液，配置为质量浓度为1，0.3，0.25，0.125，0.062 5 mg/mL。测定步骤按试剂盒说明书进行，于波长515 nm处测定吸光度，每个质量浓度设定3份，按公式（2）计算。

式中：R1——DPPH自由基清除率，%；

A1——空白组吸光度；

A2——黄精多糖样品吸光度；

A3——对照组的吸光度。

2）ABTS+自由基清除能力检测。根据试剂盒说明，将黄精多糖溶解于提取液中，配置为质量浓度1，2，3，4，5 mg/mL的黄精多糖溶液。以维C为阳性对照，将维C溶解于提取液，配置质量浓度为1，0.4，0.2，0.1，0.05 mg/mL。测定步骤按试剂盒说明书进行，于波长405 nm处测定吸光度，每个质量浓度设定3份，按公式（3）计算。

式中：R2——ABTS+自由基清除率，%；

A0——空白组吸光度；

AS——黄精多糖样品吸光度；

AC——对照组的吸光度。

1.4   统计分析

数据采用SPSS 20软件进行统计分析，以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析Ducan多重比较，不同字母表示具有显著性差异（p<0.05）。利用Origin 2019b和Design Expert软件进行数据分析和绘制图表。

2   结果与分析

2.1   单因素试验

不同条件对黄精多糖得率的影响见图2。

2.1.1   提取pH值对黄精多糖得率的影响

由图2（a）可知，随着提取pH值的增加，黄精多糖得率先升高后下降，当提取pH值为7时，黄精多糖得率最大，得率为8.01%。

2.1.2   提取温度对黄精多糖得率的影响

由图2（b）可知，随着提取温度的上升，黄精多糖得率呈现先升高后下降趋势，这可能是提取温度过高时，糖苷键被破环，导致黄精多糖得率降低^[18]。当提取温度为90 ℃时，黄精多糖得率最大，为8.59%。

2.1.3   料液比对黄精多糖得率的影响

由图2（c）可知，料液比为1∶10 ~ 1∶25时，黄精多糖得率显著上升，这可能是由于溶剂量不足导致无法完全提取多糖^[19]。当料液比为1∶25 ~ 1∶30时，黄精多糖得率没有明显变化；当料液比为1∶25时，黄精多糖得率达到最大值，为9.02%。

2.1.4   提取时间对黄精多糖得率的影响

由图2（d）可知，当提取时间为60~120 min时，黄精多糖得率显著上升；当提取时间为120~180 min时，黄精多糖得率无显著变化；当提取时间为150 min时黄精多糖得率达到最大，为9.10%。

2.2   响应面试验优化

2.2.1   响应面试验结果

响应面试验方案及结果见表2。

2.2.2   响应面模型的建立与方差分析

运用Design Expert 13软件对试验因素提取pH值（A）、提取温度（B）、料液比（C）和提取时间（D）进行多项式拟合，得到的回归模型方程为：

Y=-96.461 7+16.450 8A+0.915 8B+0.172 3C+

0.019 8D+0.001 5AB-0.012 5AC-0.000 4AD+

0.001 6BC+0.000 1CD-1.117 1A2-0.005 3B2-

0.004 0C2-0.000 1D2.

回归模型方差分析结果见表3。

由表3可知，回归模型的F值为121.44，p<0.000 1，表明回归模型具有显著性。失拟项p值为0.061 9> 0.05，失拟项不显著，表明不存在非试验因素干扰，回归模型的相关系数R2=0.996 0，校正决定系数R2adj=0.991 9，表明回归模型具有良好的拟合度，说明该模型可用于对黄精多糖得率的预测。由各因素的F值，p值得出各因素对得率的影响依次为提取pH值>料液比>提取温度>提取时间，二次项A2、B2、C2、D2的p值小于0.05，表明对得率具有显著影响。

2.2.3   响应面分析

通过各因素间的二维等高线图和三维响应面来分析各因素间的交互作用，响应面图的陡度和二维等高线图的形状可反映因素间的相关性^[20]。

提取pH值和提取温度交互作用对黄精多糖得率影响的响应面和等高线图见图3，提取pH值和料液比交互作用对黄精多糖得率影响的响应面和等高线图见图4，pH值和提取时间交互作用对黄精多糖得率影响的响应面和等高线图见图5，提取温度和料液比交互作用对黄精多糖得率影响的响应面和等高线图见图6，提取温度和提取时间交互作用对黄精多糖得率影响的响应面和等高线图见图7，料液比和提取时间交互作用对黄精多糖得率影响的响应面和等高线图见图8。

图3、图5、图7和图8显示，AB、AD、BD、CD等高线为圆形，表明AB、AD、BD、CD不存在交互作用，对响应值没有显著影响。图4和图6显示，AC和BC等高线为椭圆形，表明AC和BC间存在交互作用，对响应值具有显著影响。

2.2.4   响应面模型验证

通过响应面模型分析得到的理论最佳提取工艺条件为提取pH值7.23，提取温度92.37 ℃，料液比1∶29.48，提取时间153.879 min，理论最佳得率为9.35%。根据模型得出的最佳提取工艺，并结合实际情况调整工艺条件为提取pH值7，提取温度92 ℃，料液比1∶29，提取时间154 min，进行验证试验，平行测定3次，得到的实际得率为9.37%，与理论值接近，说明该模型具有可靠性，可用来预测黄精多糖得率。

2.3   黄精多糖体外抗氧化能力分析

2.3.1   DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一种很稳定的氮中心自由基，是衡量抗氧化能力的重要指标之一^[21]。

黄精多糖和维C对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率见图9。

由图9可知，维C对DPPH自由基的清除能力与黄精多糖相比具有显著差异。对维C质量浓度与DPPH自由基清除率进行线性拟合，得到回归方程为Y=42.603X+27.044，通过计算得到维C的IC50值为0.54 mg/mL。黄精多糖具有一定的DPPH自由基清除能力，且黄精多糖质量浓度与DPPH自由基清除率呈现剂量依赖式增长。对黄精多糖质量浓度与清除率进行线性拟合，得到回归方程为Y=10.963X+5.200 3，根据线性方程计算黄精多糖对DPPH自由基的半清除率IC50为4.09 mg/mL。

2.3.2   ABTS+自由基清除能力

ABTS法可用来评价多糖样品的总体抗氧化能力，ABTS是一种过氧化物酶底物，经氧化剂氧化后生成稳定的蓝绿色自由基阳离子，抗氧化成分能与ABTS自由基发生反应，从而使反应体系褪色^[22]。由图9可知，维C对ABTS+自由基的清除能力远远大于与黄精多糖。对维C质量浓度与ABTS+自由基清除率进行线性拟合，得到回归方程为Y=69.916X- 1.766 6，根据线性方程计算维C对ABTS+自由基的半清除率IC50为0.74 mg/mL。黄精多糖具有ABTS+自由基清除能力，且黄精多糖质量浓度与ABTS+自由基清除率呈现剂量依赖方式。对黄精多糖质量浓度与清除率进行线性拟合，得到回归方程为Y=8.6X+ 13.129，根据线性方程计算黄精多糖对ABTS+自由基的半清除率IC50为4.29 mg/mL。

3   结论

采用水提醇沉法提取黄精多糖，通过单因素试验和响应面试验确定最佳提取条件为提取pH值7，提取温度92 ℃，料液比1∶29（g∶mL），提取时间154 min，在此条件下黄精多糖得率为9.37%。体外抗氧化试验结果表明，黄精多糖对DPPH自由基（IC50= 4.09 mg/mL）和ABTS+自由基（IC50=4.29 mg/mL）具有一定的清除能力，且对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力呈现剂量依赖方式增长。研究结果可为黄精多糖的高效提取和作为一种潜在天然抗氧化剂的开发应用提供理论依据。

参考文献：

[1]SU L L，LI X M，GUO Z J，et al. Effects of different steaming times on the composition，structure and immune activity of Polygonatum polysaccharide[J]. Journal of Eth-nopharmacology，2023（310）：116351-116351.

[2]TANG X Y，XIE J，QIN Y，et al. Proteomic analysis reveals that Polygonatum cyrtonema Hua polysaccharide ame-liorates mice muscle atrophy in chemotherapy-induced ca-chexia[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical an-alysis，2023（234）：115533-115542.

[3]国家药典委员会编. 中华人民共和国药典[M]. 北京：中国医药科技出版社，2020：319-320.

[4]方如银，李铭德. 复合酶法优化黄精多糖的提取工艺研究[J]. 中国处方药，2018，16（7）：32-33.

[5]李彦力，苏艺，袁晚晴，等. 黄精主要活性成分、功能及其作用机制研究进展[J]. 现代食品科技，2023，39（12）：354-363.

[6]WEN R，LUO L，ZHANG R，et al. Structural characterization of Polygonatum cyrtonema polysaccharide and its immunomodulatory effects on macrophages[J]. Molecules，2024，29（9）：76-88.

[7]LI X Y，JIANG C L，ZHENG C，et al. Polygonatum cyrtonema Hua polysaccharide alleviates fatigue by modulating osteocalcin-mediated crosstalk between bones and muscles[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2023，71（16）：8192-8211.

[8]吕品田，段昕波. 黄精多糖对MFC胃癌荷瘤小鼠抑瘤及免疫调节作用[J]. 中成药，2020，42（8）：2169-2172.

[9]LIU N，DONG Z，ZHU X，et al. Characterization and pr-otective effect of Polygonatum sibiricum polysaccharide against cyclophosphamide-induced immunosuppression in Balb/c mice[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2018（107）：796-802.

[10]张丽萍，赵祺，崔友，等. 黄精多糖生物活性及功能性食品开发[J]. 热带农业工程，2019，43（5）：207-210.

[11]WU W J，HUANG N W，HUANG J P，et al. Effects of the steaming process on the structural properties and immunological activities of polysaccharides from Polygonatum cyrtonema[J]. Journal of Functional Foods，2022（88）：104866-104881.

[12]唐萍，朱艳，孟文潮，等. 黄精多糖的提取方法及活性研究进展[J]. 山东化工，2023，52（7）：70-72.

[13]曾珠亮，白凤，胡秀虹，等. 微波法优化提取黄精多糖工艺研究[J]. 广州化工，2023，51（2）：65-68.

[14]粟敏，陈琳，龙昱，等. 离子液体-微波辅助提取多花黄精多糖工艺研究[J]. 中药材，2016，39（9）：2075-2077.

[15]周桃英，陈年友，陈中建，等. 超声波-微波协同法提取黄精多糖工艺研究[J]. 江苏农业科学，2013，41（6）：231-233.

[16]杨茂会，周欣，谯政文，等. 黄精多糖提取、分离纯化及生物活性研究进展[J]. 食品工业科技，2022，43（12）：407-416.

[17]GU D L，WANG Y，JIN H Y，et al. Changes of physicochemical properties and immunomodulatory activity of poly-saccharides during processing of Polygonum multiflorum Th-unb[J]. Frontiers in Pharmacology，2022（13）：934710-934719.

[18]GAO D D，CHEN H，LIU H H，et al. Structure characterization and antioxidant activity analysis of polysaccharides from Lanzhou lily[J]. Frontiers in Nutrition，2022（9）：976607-976616.

[19]颜瑞辰，洪允炬，李悦，等. 响应面法优化灵芝多糖提取工艺及其抗氧化活性[J]. 菌物研究，2024，22（4）：378-386.

[20]秦枫，朱善元，李金贵，等. 响应面法优化壳聚糖对三七茎叶皂苷提取液除杂工艺的影响[J]. 河南农业科学，2019，48（7）：155-160.

[21]DU T Y，XU J C，ZHU S N，et al. Effects of spray drying，freeze drying，and vacuum drying on physicochemical and nutritional properties of protein peptide powder from salted duck egg white[J]. Frontiers in Nutrition，2022（9）：1026903-1026910.